sfide nell'estrazione di rna

Guida alla risoluzione dei problemi per l'estrazione dell'RNA totale & Purificazione

1. Cosa causa la degradazione dell'RNA?
2. Come può essere migliorata l'estrazione dell'RNA?
3. Perché l'RNA è più difficile da estrarre rispetto al DNA?
4. Come puoi prevenire la contaminazione del DNA durante l'isolamento dell'RNA?
5. Come possiamo proteggere l'RNA dalla degradazione?
6. La sterilizzazione in autoclave distrugge l'RNA?
7. Come si congelano le cellule per l'estrazione dell'RNA?
8. Come ti sbarazzi dell'RNA?
9. Come funziona l'estrazione dell'RNA?
10. Perché l'azoto liquido viene utilizzato nell'estrazione dell'RNA?
11. Qual è lo scopo dell'estrazione dell'RNA?
12. Qual è una buona resa di RNA?

Cosa causa la degradazione dell'RNA?

Ci sono due ragioni principali per la degradazione dell'RNA durante l'analisi dell'RNA. In primo luogo, l'RNA per la sua stessa struttura è intrinsecamente più debole del DNA. ... Questo rende l'RNA chimicamente più labile del DNA. L'RNA è anche più incline alla degradazione termica rispetto al DNA.

Come può essere migliorata l'estrazione dell'RNA?

Esistono 3 metodi efficaci per ottenere questo risultato:

1. Omogeneizzare completamente i campioni immediatamente dopo la raccolta in una soluzione di lisi cellulare a base caotropica (ad es. Contenente guanidinio) come il tampone di lisi disponibile nel kit PureLink RNA Mini o nel reagente TRIzol.
2. Congelare rapidamente i campioni in azoto liquido.

Perché l'RNA è più difficile da estrarre rispetto al DNA?

Il motivo principale è che l'RNA è meno stabile e più facile da degradare rispetto al DNA. ... L'RNA ha solchi più grandi del DNA, il che rende più facile essere attaccati dagli enzimi. Gli enzimi che degradano l'RNA, le ribonucleasi (RNasi) sono abbondanti nell'ambiente e difficili da rimuovere completamente.

Come puoi prevenire la contaminazione del DNA durante l'isolamento dell'RNA?

Il problema a volte può essere evitato costringendo i primer a superare i confini degli introni, ma questo è spesso difficile ei metodi attualmente utilizzati per ridurre la contaminazione del DNA includono la digestione della DNAse I, il frazionamento del gel, il fenolo acido: estrazione con cloroformio e precipitazione con cloruro di litio.

Come possiamo proteggere l'RNA dalla degradazione?

Per prevenire la degradazione, i campioni di RNA vengono generalmente conservati congelati a −20 ° C o −80 ° C o sotto azoto liquido.

La sterilizzazione in autoclave distrugge l'RNA?

Assicurarsi di separare i reagenti utilizzati per il lavoro sull'RNA dai "reagenti per uso generale" in laboratorio. Tutte le soluzioni, ad eccezione dei tamponi Tris, devono essere trattate con DEPC (o DMPC) allo 0,1% per una notte a temperatura ambiente e quindi sterilizzate in autoclave. L'autoclave idrolizza e distrugge DEPC e DMPC non reagiti.

Come si congelano le cellule per l'estrazione dell'RNA?

Posizionare il tessuto in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml o 15 ml conica e congelare a scatto su ghiaccio secco. In alternativa, avvolgere il tessuto in un foglio di alluminio e congelare con azoto liquido.

Come ti sbarazzi dell'RNA?

La contaminazione da RNA può essere rimossa aggiungendo 2 microlitri di RNasi A (10 mg / ml, Fermentas) a 20 microlitri di DNA sciolti in tampone TE (Tris-EDTA, pH = 8,0) e incubare per 3-4 ore a 37 ° C.

Come funziona l'estrazione dell'RNA?

Metodi di estrazione organica

Durante la centrifugazione, il campione si separa in tre fasi: una fase organica inferiore, una fase centrale che contiene proteine ​​denaturate e gDNA e una fase acquosa superiore che contiene RNA. La fase acquosa superiore viene recuperata e l'RNA viene raccolto mediante precipitazione e reidratazione con alcol.

Perché l'azoto liquido viene utilizzato nell'estrazione dell'RNA?

Viene utilizzato azoto liquido in quanto ha una temperatura molto bassa di -176 ° C che aiuta a polverizzare la sostanza dura del tessuto vegetale e animale per trasformarla in polvere. Aiuta anche a disattivare la DNAasi per digerire il DNA .

Qual è lo scopo dell'estrazione dell'RNA?

L'estrazione dell'RNA è la purificazione dell'RNA da campioni biologici. Questa procedura è complicata dalla presenza onnipresente di enzimi ribonucleasi nelle cellule e nei tessuti, che possono degradare rapidamente l'RNA.

Qual è una buona resa di RNA?

Un A₂₆₀/UN₂₈₀ un rapporto maggiore di 1,8 è generalmente considerato un indicatore accettabile di RNA di buona qualità con un basso livello di contaminazione proteica [14, 15]. Un A₂₆₀/UN₂₃₀ un rapporto superiore a 1,8 viene utilizzato come indicatore di RNA estratto con un basso livello di contaminazione da polisaccaridi.