problema del double digest della mappatura delle restrizioni

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Paul Montgomery
problema del double digest della mappatura delle restrizioni
  1. Perché ci sono doppie restrizioni alla digestione?
  2. Perché il mio digest delle restrizioni non funziona?
  3. Cosa succede se aggiungi una quantità eccessiva di enzima di restrizione?
  4. Possono due enzimi di restrizione tagliare nello stesso sito?
  5. Come si calcola il digest delle restrizioni?
  6. Quanto tempo dovrebbe richiedere la digestione di una restrizione?
  7. È necessaria l'inattivazione termica degli enzimi di restrizione?
  8. Gli enzimi di restrizione scadono?
  9. Come si può prevenire la digestione delle restrizioni?
  10. Perché un enzima di restrizione non dovrebbe tagliare?
  11. Come si selezionano gli enzimi di restrizione?
  12. Perché gli enzimi di restrizione devono essere tenuti in ghiaccio?

Perché ci sono doppie restrizioni alla digestione?

La digestione simultanea di un substrato di DNA con due endonucleasi di restrizione (doppia digestione) è una procedura comune per risparmiare tempo. La selezione del miglior NEBuffer per fornire condizioni di reazione che ottimizzano l'attività enzimatica ed evitano l'attività stellare associata ad alcuni enzimi è una considerazione importante.

Perché il mio digest delle restrizioni non funziona?

Digestione incompleta o assente a causa dell'attività enzimatica bloccata dalla metilazione del DNA. Se il tuo enzima è attivo e digerisce il DNA di controllo e la reazione viene impostata utilizzando condizioni ottimali, ma continui a riscontrare problemi di digestione, potrebbe essere perché l'enzima è inibito dalla metilazione del DNA stampo.

Cosa succede se aggiungi una quantità eccessiva di enzima di restrizione?

Quando si utilizza una quantità eccessiva o insufficiente di enzimi può verificarsi una digestione incompleta. La presenza di contaminanti nel campione di DNA può inibire gli enzimi, provocando anche una digestione incompleta.

Possono due enzimi di restrizione tagliare nello stesso sito?

Puoi fare con controlli adeguati come la digestione a restrizione singola ed entrambi gli enzimi insieme per assicurarti che entrambi stiano tagliando indipendentemente e insieme e andare avanti con i tuoi piani. Sfortunatamente ero limitato a questi due enzimi che avevano dei siti uno accanto all'altro!

Come si calcola il digest delle restrizioni?

Calcola la quantità di ciascuno che devi aggiungere a una digestione di restrizione per digerire 5ug (5000 ng) di DNA con 5 unità di enzima. Ad esempio, se il mio DNA è a 190 ng / ul, avrei bisogno di: 5000 ng / 190 ng / ul = 26 ul del mio campione.

Quanto tempo dovrebbe richiedere la digestione di una restrizione?

* Suggerimento professionale * A seconda dell'applicazione e della quantità di DNA nella reazione, il tempo di incubazione può variare da 45 minuti a una notte. Per la digestione diagnostica, 1-2 ore sono spesso sufficienti. Per digerire con >1 µg di DNA utilizzato per la clonazione, si consiglia di digerire per almeno 4 ore.

È necessaria l'inattivazione termica degli enzimi di restrizione?

FAQ: è necessario inattivare gli enzimi di restrizione dopo la digestione del vettore? L'inattivazione delle endonucleasi di restrizione non è generalmente necessaria, ma in alcuni casi potrebbe aumentare l'efficienza di trasformazione.

Gli enzimi di restrizione scadono?

Tutti gli enzimi vengono testati per l'attività ogni 3-6 mesi; la data di scadenza è riportata sull'etichetta attaccata a ciascuna fiala di enzima. Dopo trentacinque anni di esperienza con gli enzimi di restrizione, abbiamo riscontrato che la maggior parte sono molto stabili se conservati a -20 ° C nel buffer di conservazione consigliato.

Come si può prevenire la digestione delle restrizioni?

Protocollo di digestione enzimatica di restrizione

  1. Aggiungere i componenti a una provetta pulita nell'ordine mostrato: ...
  2. Incubare la reazione alla temperatura di digestione (solitamente 37 ° C) per 1 ora.
  3. Fermare la digestione mediante inattivazione al calore (65 ° C per 15 minuti) o aggiunta di EDTA a concentrazione finale di 10 mM.
  4. Il DNA digerito è pronto per l'uso in applicazioni di ricerca.

Perché un enzima di restrizione non dovrebbe tagliare?

FAQ: Perché il mio enzima di restrizione non taglia il DNA? ... Se il DNA di controllo viene scisso e il DNA sperimentale resiste alla scissione, i due DNA possono essere miscelati per determinare se un inibitore è presente nel campione sperimentale. Se è presente un inibitore (spesso sale, EDTA o fenolo), il DNA di controllo non si taglierà dopo la miscelazione.

Come si selezionano gli enzimi di restrizione?

Quando si selezionano gli enzimi di restrizione, si desidera scegliere enzimi che:

  1. Fianca l'inserto, ma non tagliare all'interno dell'inserto.
  2. Si trovano nella posizione desiderata nel plasmide ricevente (di solito nel sito di clonazione multipla (MCS)), ma non tagliare altrove sul plasmide.

Perché gli enzimi di restrizione devono essere tenuti in ghiaccio?

Gli enzimi hanno davvero bisogno di essere tenuti sotto ghiaccio tutto il tempo? ... Gli enzimi devono essere conservati e utilizzati alle loro temperature ottimali. Gli enzimi sono generalmente conservati in glicerolo a -20 ° C. Ciò impedisce loro di congelarsi completamente, il che provoca la denaturazione delle proteine ​​e si traduce in una perdita di attività.


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